PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別。PCR驗室又叫基因擴增實驗室。
PCR技術原理：
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。
在聚合酶鏈式反應實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。（ DNA高溫變性低溫復性）發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。
下面一起了解提高PCR反應結果成功的參考技巧：
1、將PCR反應的試管與反應板緊貼。
2、當酶反應混合物以70℃“熱啟動"開始循環時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。
3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對于有問題的PCR反應，例如模板的量少，模板不純和環狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預變性，后加模板進行正常PCR擴增。
5、沒有擴增產物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。
6、泳道中出現模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補加MgCl2，因為在PCR反應中可能缺少游離的Mg2+。
7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
8、檢查模板和引物的用量。
9、增加循環次數和/或模板DNA的用量。
10、泳道中出現模糊條帶： 減少循環次數或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過68℃。 重新設計引物或設計更長的引物。
11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。最佳反應體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數反應中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數情況下可以得到滿意的結果。建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結果，優化Mg2+的濃度是必需的。
12、基因組DNA模板的質量顯著影響PCR反應。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統的基因組DNA能擴增片段至10kb。要擴增更長的片段應使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關文獻。降低二級結構和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應的退火溫度來增加反應的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優先擴增的影響。
13、變性：第一步變性在94℃下進行2分鐘。在循環過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應該盡可能的降低變性溫度。
14、延伸：68--72℃下進行延伸操作。循環延伸：盡量采用循環延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產物補平后再進行。測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產生均一的（染色體）帶型。
15、引物設計： 一般長度20-30bp； 至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級結構； 引物對的Tm值應該接近。
注意事項：
1、加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
2、使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
3、按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
4、底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
5、洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
6、使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器 。
7、實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
8、試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
9、不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
ELISA定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性具定量意義。在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述如下。
1、 間接法和夾心法
這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA中，正常人血清反應后常可出現呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結果時，宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數據。先讀出標本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。
a. 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準。
用此法判斷結果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化，陽性和陰性的對照品應符合一定的規格，須配用的儀器，并嚴格按規定操作。陽性判定值公式中的常數是在這特定的系統中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。現舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng /ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數（NC X ）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（P-N）必須大于一個特定的數值（例0.400），試驗才有效。3個陰性對照A值均應≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=NCX+0.05
標本 A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。
根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質控作用，試劑變質和操作不當均會產生"試驗無效"的后果。
b. 標本/陰性對照比值
在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（ S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（patient）的縮寫，不應誤解。為避免混淆，宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標準，現多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統應該用實驗求出各自的S/N的閾值。應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩沖液，以致反應后產生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規，如N<0.05（或其他數值），則按0.05計算，否則將出現假陽性結果。
2、 競爭法
在競爭法 ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調節陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應為敏感。
競爭法 ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。
a. 陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照 A值，現舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均值（NC X ）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（N-P）必須大于一個特定的數值（例如0.300）,試驗才有效。3個陰性對照A值均應小于2.000，而且應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算×NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標本A值≤陽性判定值的反應為陽性，A＞陽性判定值的反應為陰性。
b. 抑制率法
抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑制程度，按下式計算：
抑制率（%）= （陰性對照A值-標本A值）×/陰性對照A值
一般規定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。
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