酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種基于多孔板的技術(shù)，用于確定生物樣品中的抗體、抗原或其他蛋白質(zhì)的濃度，使用發(fā)色、熒光或發(fā)光的讀數(shù)。自20世紀(jì)60年代開發(fā)以來，它們已成為許多診斷和生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室的主力軍，在一系列應(yīng)用中表現(xiàn)出特異性、靈敏度和可重復(fù)性。常見的例子包括各種傳染病的檢測和妊娠試驗(yàn)。使用ELISA有很多優(yōu)點(diǎn)，但必須適當(dāng)設(shè)置和優(yōu)化，以確保結(jié)果可靠。本指南強(qiáng)調(diào)確保ELISA實(shí)驗(yàn)成功的技巧。免疫檢測法的精確性表現(xiàn)為單次實(shí)驗(yàn)孔間（批內(nèi)）的重復(fù)性和多次實(shí)驗(yàn)之間（批間）的重復(fù)性。CV值高則表明精確度低，通常由以下兩個(gè)原因造成：移液技術(shù)和洗滌技術(shù)。
一、提前規(guī)劃
提前規(guī)劃可以幫助工作流程有效運(yùn)行，并減少錯(cuò)誤和重測的可能性；因此，有必要在工作流程開始前徹底規(guī)劃工作流程的所有組成部分。流程圖和檢測設(shè)計(jì)是重要的規(guī)劃考慮因素。需要確定的因素包括：待測樣品的數(shù)量、復(fù)測次數(shù)和所需的試劑平板/試劑盒的數(shù)量。
ELISA樣品的復(fù)測是很重要的，因?yàn)檫@將突出異常的結(jié)果。為提高可靠性，最好使用三份樣本，但必要時(shí)也可使用重復(fù)樣本。方案中還需要考慮到質(zhì)控，因?yàn)檫@將表明檢測是否成功，是否保持在動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，并能進(jìn)行檢測間的比較和校正。使用流程圖來計(jì)劃你的ELISA檢測也將有助于減少任何樣品位置的錯(cuò)誤。
當(dāng)使用不同的試劑在多個(gè)平板或多個(gè)檢測上進(jìn)行時(shí)，所有的平板都需要有明確的標(biāo)簽和試劑的隔離，以避免混淆。此外，所有的試劑必須徹底解凍（如果需要的話），在使用前進(jìn)行混合并注明日期，并檢查任何光敏試劑是否變質(zhì)。
另一個(gè)需要考慮的因素，特別是對于夾心法來說，就是一抗和二抗所來自的物種。當(dāng)使用抗體對時(shí)，必須對它們進(jìn)行測試以找到最理想的信號，并盡量減少任何交叉反應(yīng)。
許多市面上的試劑盒提供了抗體，然而，如果一個(gè)項(xiàng)目涉及到一個(gè)新的目標(biāo)，那么針對已知和未知的樣品測試一系列的抗體是很重要的。在優(yōu)化檢測時(shí)，嘗試不同的抗體稀釋度以提高檢測的靈敏度，同時(shí)盡量減少交叉反應(yīng)和背景噪音。嘗試一系列的樣品稀釋度也可以幫助這個(gè)過程。
封閉是工作流程的另一個(gè)關(guān)鍵部分，它能減少背景信號并將假陽性結(jié)果降至最低。一個(gè)好的封閉緩沖液將減少非特異性結(jié)合，同時(shí)不與（或只與最小的）所用的抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生反應(yīng)。
封閉緩沖劑通常是蛋白質(zhì)或非離子型洗滌劑，所用的類型取決于幾個(gè)因素，包括所用的抗體、抗原和洗滌劑試劑以及平板的表面化學(xué)性質(zhì)。
最常見的封閉劑類型，牛血清白蛋白（BSA），是一種蛋白質(zhì)。如果你的背景信號很高，你懷疑封閉不足，使用更高濃度的封閉劑或增加封閉時(shí)間可能有幫助。相反，如果你有一個(gè)持續(xù)的背景問題，可能值得投入時(shí)間來優(yōu)化你所使用的封閉劑類型。
二、樣品處理和移液技術(shù)
試劑和樣品處理不當(dāng)或儲(chǔ)存不正確會(huì)影響下游分析，因?yàn)椴煌木彌_劑和試劑會(huì)有不同的儲(chǔ)存要求。例如，有些必須儲(chǔ)存在冰箱里，有些在室溫下，有些用感光罩（如鋁箔）。
如果有計(jì)劃在未來的實(shí)驗(yàn)中使用相同的樣品，那么應(yīng)該把它們放入等分試樣中，需要時(shí)再取出來。這將避免多次冷凍/解凍循環(huán)，保持準(zhǔn)確的結(jié)果。當(dāng)樣品準(zhǔn)備使用時(shí)，應(yīng)在冰上解凍（或根據(jù)方案）。移液技術(shù)注意事項(xiàng)要點(diǎn)如下：
1. 移液時(shí)，槍頭應(yīng)對準(zhǔn)孔，避免接觸孔壁及底部。
2. 移液后輕輕晃動(dòng)混勻試劑。
3. 如果您的樣品具有黏性，請預(yù)先潤洗槍頭以消除表面張力的影響。吸液時(shí)等待片刻使體積平衡后再取出。
4. 移液不充分或移液體積不均，說明移液器需要校正。必要時(shí)請檢查移液器并重新校正。
5. 加樣時(shí)，不同的試劑標(biāo)準(zhǔn)品和樣本間都要確保更換槍頭，避免交叉污染。
6. 確保使用合適的槍頭。不合適的槍頭無法正確量取吸液和加樣的體積。
移液工作站
三、確保一致性和準(zhǔn)確性
獲得一致和準(zhǔn)確結(jié)果的方法之一是確保實(shí)驗(yàn)臺(tái)被適當(dāng)?shù)卦O(shè)置，使所有的組件和儀器都觸手可及。使用經(jīng)過校準(zhǔn)的精密移液器也將限制移液過程中的任何不一致。
運(yùn)行內(nèi)精密度是指各孔之間的誤差。如前所述，加入重復(fù)樣本對識(shí)別錯(cuò)誤和異常情況很重要。變異系數(shù)（CV）是一個(gè)描述群體內(nèi)變異性的比率，與觀察值的絕對值無關(guān)。當(dāng)解釋ELISA的數(shù)據(jù)時(shí)，%CV對于識(shí)別樣品復(fù)制中的任何不一致是很有用的。這表現(xiàn)在測定后的光密度（OD）值之間的變化。總之，%CV越低，結(jié)果越精確。
檢測間的精確性是指板間或檢測間的重復(fù)性，如在不同的日子完成的檢測。盡管商業(yè)化的ELISA試劑盒有測定間質(zhì)量控制，但科學(xué)家們必須保留一個(gè)詳細(xì)的筆記本，記錄在方案中任何時(shí)候的變化，以便其他研究人員能夠以同樣的方式完成同樣的實(shí)驗(yàn)，獲得同樣的結(jié)果。這也使得檢測能夠隨著時(shí)間的推移進(jìn)行監(jiān)測，以確定任何系統(tǒng)性問題或檢測性能的下降。
四、避免污染
污染會(huì)在ELISA數(shù)據(jù)的下游分析中造成許多問題，如孔與孔之間的高差異、高背景值和弱或低信號強(qiáng)度。有幾種方法可以防止污染：
1.在一個(gè)干凈的環(huán)境中工作；
2.通過去離子或蒸餾對所有的水進(jìn)行消毒；
3.每次轉(zhuǎn)移時(shí)使用新的和干凈的試劑；
4.在兩個(gè)樣品之間使用新的移液器吸頭；
5.準(zhǔn)備和應(yīng)用樣品時(shí)要小心，避免濺到或交叉污染；
6.如果使用自動(dòng)化，確保系統(tǒng)被清潔，試劑供應(yīng)經(jīng)常更新；
7.只去除試劑需要的部分，避免將其倒回庫存瓶中，因?yàn)檫@可能會(huì)引入污染物。
五、正確的洗板技術(shù)
正確的洗滌和沖洗方案尤其重要。在下游分析過程中，不充分、不一致和/或過度清洗會(huì)造成問題。有許多洗板的方法，包括使用自動(dòng)洗板機(jī)、手動(dòng)分流器或洗瓶。當(dāng)手動(dòng)吸出孔中的液體時(shí)，要注意不要碰到孔的底部--吸管的尖端應(yīng)該放在孔的一側(cè)。為了減少背景信號，清洗量需要足夠大，以去除孔中未結(jié)合的樣品和試劑。然而，過度洗滌會(huì)減少目標(biāo)信號。
確保所有的孔都被平均清洗，以避免在整個(gè)檢測板上引入信號變化。要做到這一點(diǎn)，如果是手工清洗，請檢查移液器吸頭是否固定好，如果使用自動(dòng)洗板機(jī)，所有分配和吸液的噴頭必須沒有堵塞。你可以在空板上測試它們，以檢查它們是否同樣工作。
1. 如果使用自動(dòng)洗板機(jī)或多通道移液器，請確保進(jìn)出口能正常運(yùn)作。
2. 最后一次洗滌后，翻轉(zhuǎn)酶標(biāo)板倒出多余的洗滌液，并在吸水紙上拍干液體。洗板太快或太慢都會(huì)降低精確度。不能讓孔內(nèi)液體自然風(fēng)干，需立即進(jìn)行下一步操作。
3. 按照說明書，添加足量的洗滌液至孔內(nèi)，并保證洗滌完全。
4. 由于洗滌液不是通用的，當(dāng)試劑盒內(nèi)的洗滌液用完時(shí)，請不要使用其他試劑盒中的洗滌液。如有需要，可聯(lián)系技術(shù)支持尋求幫助。
5. 不要減少洗滌時(shí)的浸泡時(shí)間或跳過浸泡的步驟。
6. 按照說明書上的洗滌次數(shù)清洗，隨意改變洗滌的次數(shù)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的精確性。
六、數(shù)據(jù)歸一化
準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析是ELISA工作流程中非常重要的一步，它解決了測定間的變異性問題，這可能受到許多因素的影響，如溫度和發(fā)育。為了限制這些因素對檢測結(jié)果的影響，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)之間通過比較每個(gè)板上的標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行歸一化。
七、保持在動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)
至關(guān)重要的是，檢測樣品要保持在板式讀數(shù)器的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，否則結(jié)果將不具代表性，儀器的動(dòng)態(tài)范圍可以在機(jī)器手冊中找到。在開發(fā)檢測方法和確定樣品稀釋度時(shí)，最高和最低的陽性樣品都應(yīng)落在儀器的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品通常與ELISA試劑盒一起提供；然而，這些也可以獨(dú)立采購。
總的來說，ELISA是許多實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)重要組成部分。遵循上面的提示將幫助任何人產(chǎn)生準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。
