【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：嗜肺巴斯德桿菌探針法 qPCR 試劑盒
【產(chǎn)品編號】AP9696
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
產(chǎn)品就是以探針法 qPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測嗜肺巴斯德桿菌的試
劑盒 。
【檢驗原理】
嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurella pneumophila)在自然界中分布廣泛，它有兩
種生物型，主要感染嚙齒類動物，對實驗小鼠、大鼠和豚鼠的危害較大。嗜肺巴斯德
桿菌作為一種條件致病菌，能夠引起免疫缺陷動物或免疫功能低下的動物產(chǎn)生嚴(yán)重的
肺炎，并可能導(dǎo)致動物死亡。
本試劑盒根據(jù)探針法熒光定量 PCR 原理開發(fā)的嗜肺巴斯德桿菌檢測試劑
盒。本產(chǎn)品即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。引物等組分經(jīng)過優(yōu)化，靈敏
度高。提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。特異性高，引物是根據(jù)嗜肺巴斯德桿菌
DNA 序列高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。既可用于定性
檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)量級。本產(chǎn)品足
夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。本產(chǎn)品只能用于科研。
【試劑組成】
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【運輸及保存】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】
樣品 DNA。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系
列熒光定量 PCR 檢測儀。
【使用方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污
染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品
不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
3. 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分
鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充
分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充
分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
2. 樣本處理（樣本處理區(qū)）
2.1 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對
照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上
一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。
另外用水作為 NC。
2.2 核酸提取：核酸提取可以采用上海撫生實業(yè)有限公司的核酸提取或純化試劑，操
作方法按照說明書進(jìn)行。
3.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
準(zhǔn)備足量的 PCR 管(樣品管、陰性對照管、陽性對照管)，向各 qPCR 管中分別
加入下列成分：
4.添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 5 uL 模板，順序為陰性對照（DEPC-H2O）、待測樣
品模板、嗜肺巴斯德桿菌 qPCR 陽性對照，離心 30 秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)
5.擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))：
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴(kuò)增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下
【結(jié)果判定】
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制
標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，
推算出其濃度。
2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對照（1×10E5 拷貝/μL）結(jié)果：Ct 值<30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的 S 型
曲線。陰性對照結(jié)果：Ct 值>40 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。樣本檢
測結(jié)果：Ct 值<38，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出嗜肺巴斯德桿菌，結(jié)果為
陽性；Ct 值>40 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出嗜肺巴斯德桿菌，結(jié)果為陰性；
Ct 值在 38-40 范圍，應(yīng)對樣本進(jìn)行復(fù)檢，如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct 值仍在 38-40 范圍，
有明顯指數(shù)增長，則判定為陽性，否則為陰性。
【注意事項】
1．PCR 操作各階段應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作，避免交叉污染。
2．試劑盒各組分使用前應(yīng)充分融化混勻，離心數(shù)秒后使用。
3．各組分不得與其他產(chǎn)品或不同批號的相應(yīng)成分進(jìn)行互換。
4．待測標(biāo)本若不及時檢測，應(yīng)保存于-20℃或-70℃。
5．樣品的處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作。
6．PCR 操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗和受過專業(yè)培訓(xùn)。
7．本試劑盒僅用于科研使用，不做為臨床診斷使用。
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資料/datasheet
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