培養基滅菌是一個至關重要的步驟，以確保實驗的無菌條件和數據的可靠性。滅菌過程需要考慮多種因素，包括培養基的成分、微生物的耐熱性、pH值、培養基中顆粒的大小、泡沫的存在以及滅菌器內空氣的排除情況。
滅菌的方法很多，在實驗室可以使用干熱滅菌、對于環境可以使用化學試劑滅菌，但化學試劑的滅菌方法有很大的限制。在工業生產中，對于培養基、管道、設備的滅菌，通常采用蒸汽加熱到一定的溫度，并保溫一段時間的滅菌方法，稱之為濕熱滅菌。
濕熱滅菌的顯著優點是：使用方便，無污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培養基中，也可以通過管道排出。培養基滅菌的效果，影響因素很多，除了培養基內雜菌的種類和數量，滅菌溫度的高低，時間長短外，還取決于：
1.營養成分的保持
濕熱滅菌時，微生物被殺死的同時，培養基的營養成分也遭到了一定的破壞，特別是氨基酸和維生素。如在121℃，僅20min，就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞，蛋氨酸和色氨酸也有相當數量被破壞。在熱的作用下某些營養成分還可能因受熱而相互之間發生反應，造成培養基中原有營養成分的數量變化，因而影響培養基質量。
2.微生物的耐熱性
細菌芽孢的熱阻較大，滅菌所需要的時間取決于把細菌芽孢減少到所規定數目的時間。
3.pH值
pH值對微生物的耐熱性影響很大。pH值介于6.0~8.0時，微生物*不易死亡。pH<6.0時，微生物比較容易死亡，此時H+很容易滲入微生物的細胞，從而改變細胞的生理反應，促使其死亡。所以培養基的pH越低，所需的時間也越短。
4.培養基成分
油脂、糖類及蛋白質等組成的高濃度有機物會包于細胞的周圍形式一層薄膜、影響熱的傳導。而高濃度的鹽類、色素則削弱其耐熱性，滅菌較易。例如：大腸桿菌在水中加熱至60-65℃便死亡，在10%糖液中需70℃加熱4-6分鐘才死亡，在30%糖液中需30分鐘才死亡。一般糖類含量較多的時候選用115℃，30分鐘；一般的培養基可選擇121℃20分鐘。
5.泡沫
泡沫中的空氣形成隔熱層，使熱量難以滲透進去，殺死其中的雜菌。
6.顆粒
顆粒小，容易滅菌，顆粒大，則難滅菌。對于含有少量較大顆粒及粗纖維的培養基，可用粗濾的方法(不應影響培養基質量)予以除去，培養基結塊會造成培養基滅菌的不*。
7.滅菌鍋內空氣是否排凈
這個是影響滅菌是溫度和壓力比例關系的要點，同樣達到了相同的壓力的情況下，如果空氣未能排凈，也就是說不是純蒸汽滅菌，此時的溫度不一定能達到目的要求，會嚴重影響滅菌效果。
