免疫熒光（IF）是一種用于檢測以及識別細胞和組織中蛋白質和其他分子的亞細胞分布和遷移的強大檢測技術。IF可用作免疫組織化學 (IHC) 或免疫細胞化學 (ICC) 中使用的傳統顯色標記的替代物。通過使用多種標記物的二級抗體，可以研究感興趣蛋白的共定位，這是不能通過常規IHC或ICC實現。這是同時分析許多目標蛋白時的一個優勢，可同時生成大量亞細胞定位的準確數據。免疫熒光染色是一種常用的細胞和組織學研究技術，它利用特異性抗體與標記熒光染料結合，來檢測和定位細胞中的特定蛋白質或其他分子。
以下是免疫熒光染色的原理和步驟：
原理： 免疫熒光染色的原理是利用特異性抗體與目標蛋白質結合，再使用熒光標記的二抗與原抗體結合，從而標記目標蛋白質。熒光信號可以通過熒光顯微鏡觀察，以顯示目標蛋白質的位置和分布。免疫熒光染色可以用于檢測和定位細胞中的特定蛋白質、抗原、細胞器等，對于研究細胞和組織的結構、功能和病理生理過程具有重要意義。
細胞免疫熒光染色適用于鑒定細胞的免疫熒光檢測的實驗方法。
步驟：
1、細胞或組織樣品的固定：通常使用甲醛或乙醛來固定細胞或組織，以保持其形態和蛋白質結構的完整性。
2、抗體的孵育：將特異性抗體加入到樣品中，與目標蛋白質結合。
3、洗滌：用緩沖液洗去未結合的抗體。
4、二抗的孵育：加入熒光標記的二抗，與原抗體結合。
5、洗滌：用緩沖液洗去未結合的二抗。
6、熒光顯微鏡觀察：使用熒光顯微鏡觀察樣品，熒光信號可顯示目標蛋白質的位置和分布。
實驗過程 (48孔板為例)：
1、細胞種植：將細胞消化后按照所需濃度種植于48孔板，置于37°C二氧化碳培養箱培養過夜。
2、固定：取出48孔板，棄去培養基，每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，每孔加入200μl 的4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min。
3、洗滌：每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，重復3次。
4、通透：每孔加入200μl 的0.1% Triton x-100，室溫靜置15min。（膜表達的蛋白鑒定建議不通透，具體參考抗體說明書）
5、洗滌：每孔加入PBS 500μl，靜置5min，吸走液體，重復3次。
6、封閉：每孔加入500μl 5%牛血清封閉液，37℃孵育2h或者置于冷藏冰箱中過夜，棄去液體。
5.7一抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀釋的抗體（稀釋比例參考抗體說明書），37°C靜置2h或者4℃過夜。
8、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復3次。
9、封閉：每孔加入200μl 5%牛血清封閉液，室溫封閉15min。（本底高的可以加這一步）
10、二抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀釋的二抗（種屬和一抗的要對應，舉例：一抗是來源是兔抗X，二抗就用Y 抗兔-熒光，稀釋比例參考抗體說明書），37℃避光孵育1h。
11、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復3次。
12、染核：Hoechst 濃度2μg/ml，每孔200 μl，室溫避光染色15min。
13、洗滌：PBST每孔500μl，靜置5min，吸走板中液體，重復3次。
14、拍照：洗滌完畢每孔加入200μl PBS,將細胞置于顯微鏡下觀察，選擇所需倍數，拍照保存。
