實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR),qPCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值設(shè)為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中也可以手動(dòng)調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號被認(rèn)為是真實(shí)的信號，用于定義Ct值。Ct會(huì)受到閾值的影響，每次試驗(yàn)由于樣品和儀器的不同會(huì)導(dǎo)致基線不同，進(jìn)而影響閾值和Ct值。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會(huì)存在差異。
1、與Ct值有關(guān)的參數(shù)
標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。
相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R^2) ：反映了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，通常要求>0.99。
擴(kuò)增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴(kuò)增或者是引物二聚體造成。
斜率Slope ：當(dāng)擴(kuò)增效率為100%時(shí)斜率為-3.32，當(dāng)90%-110%時(shí)的斜率為-3.58 ~ -3.10。
2、Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系
理想情況下，qPCR的模板經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴(kuò)增效率E）^循環(huán)數(shù)n。但是由于E通常無法達(dá)到100%，并且在擴(kuò)增的后期，擴(kuò)增效率會(huì)逐漸降低，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。
由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知濃度樣品同時(shí)擴(kuò)增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時(shí)，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果的不準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同時(shí)定量標(biāo)準(zhǔn)品的量值需要準(zhǔn)確可靠。用qPCR進(jìn)行定量，理論上可行，實(shí)際上很難獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。
